纳豆芽孢杆菌发酵牡蛎的工艺研究（一） 具有高纤维蛋白溶解活性

目前，纳豆国内外的芽孢艺研纳豆相关食品种类很多，如纳豆复合饮料、杆菌纳豆咀嚼片、发酵纳豆压片糖果等。牡蛎纳豆芽孢杆菌与益生菌类似，纳豆在生长繁殖过程中可以产生多种代谢产物：①多种活性抗菌物质，芽孢艺研可以有效地抑制沙门氏菌等多种致病菌，杆菌能够促进消化，发酵增强免疫力；②维生素类物质，牡蛎如维生素K2可以与寡糖偶合，纳豆从而使机体更有效地利用营养物质；③)γ-多聚谷氨酸(γ-PGA)，芽孢艺研在抑菌包装方面具有很大的杆菌利用价值；④低聚果糖，可用作可食用淀粉薄膜的发酵功能性成分；⑤纳豆激酶，具有高纤维蛋白溶解活性，牡蛎可用作心血管疾病的治疗药物。由于分子量较低且对pH低的环境稳定性高，因此可用于口服。由于能够产生如此众多的活性物质和功能性物质，因而纳豆芽孢杆菌具有多种利用价值，可作为食品防腐剂、微生态制剂、抗菌剂、免疫增强剂等。

牡蛎的蛋白质含量高，维生素、锌的含量丰富，具有高营养价值。但生牡蛎可能含有有害细菌，例如副溶血性弧菌和沙门氏菌都是常见的食源性病原菌，因此生食牡蛎有一定的安全隐患。本文以牡蛎为原料，通过纳豆芽孢杆菌发酵制得的富含氨基酸类物质的发酵液经浓缩后可用于开发营养口服液，也可用于生物肥料、动物饲料等，能够降低牡蛎及其制品生食潜在的安全隐患，同时提高牡蛎加工利用可能性，提高牡蛎经济附加值。

一、材料与方法

1、材料

牡蛎：市售；纳豆菌发酵粉：上海贺普实业有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，国药集团化学试剂有限公司。

2、仪器与设备

DH-600AB电热恒温培养箱：北京中兴伟业仪器有限公司；LS-50HD立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；722紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司。

3、方法

（1）纳豆芽孢杆菌的活化及纯化

纳豆芽孢杆菌的活化和纯化参照宋光艳的操作过程。于无菌条件下取0.3g的纳豆芽孢杆菌发酵粉于装有5mLLB液体培养基的试管中，37℃培养24h，然后用移液枪吸取1mL菌悬液至LB液体培养基试管中转接2代恢复菌种活力。于无菌条件下将活化后的纳豆芽孢杆菌进行纯化，37℃培养24h，然后在无菌条件下挑取形态良好的菌落接种于LB液体培养基试管中，在37℃的条件下培养24h，最后将菌种转接至LB固体斜面培养基中并于4℃条件下冷藏保存。

（2）牡蛎发酵培养基制备

牡蛎肉解冻，清洗干净，除去杂质，在料理机中打成糊状，分装至250mL锥形瓶中，固定料液比1:4(g／mL)、发酵温度37℃，调节pH，葡萄糖添加量2％，于121℃下高压灭菌15min，得到牡蛎发酵培养基。

（3）单因素试验优化发酵工艺

本试验将固定料液比1:4(g／mL)、发酵温度37℃和葡萄糖添加量2％，纯化后冷藏菌种接种于LB液体培养基中活化，调配至菌悬液浓度为10⁷cfu／mL。分别以发酵pH、接种量和发酵时间为变量，进行单因素试验，每组试验采取三个平行和一组空白对照，其中发酵pH为5、6、7、8、9；接种量为2％、4％、6％、8％、10％；发酵时间为12h、24h、36h、48h、60h。空白对照组为发酵pH7、接种量O％、发酵时间12h、24h、36h、48h、60h各一个。以发酵液中氨基态氮含量为测定指标，研究三个因素对牡蛎发酵效果的影响，对发酵工艺进行初步优化。

（4）正交试验优化发酵工艺

在进行单因素试验和分析数据结果后，选择适宜的发酵pH条件范围、接种量和发酵时间，以及空白对照组进行三因素三水平L₉(3⁴)正交优化试验。

（5）蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。具体操作流程如下：

（6）氨基态氮含量的测定

参照国标GB18186-2000《酿造酱油》规定采用甲醛电位滴定法测定氨基态氮含量。具体操作流程如下：

二、结果与分析

1、单因素试验结果

如图1所示，在发酵时间和接种量一定的基础上，当牡蛎培养基的pH为5～7时，氨基态氮的含量呈上升趋势，在pH为7时氨基态氮的含量达到了最高值，pH为7～8时氨基态氮含量稍有下降，pH为8～9时下降较为明显，这可能是因为纳豆芽孢杆菌生长的最适pH为7，而且纳豆激酶在pH为7时纳豆激酶活力最高。蛋白质含量在pH为5～7时呈下降趋势，从pH7～9则呈上升趋势。可能与纳豆芽孢杆菌产酶活力下降有关。

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